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药典2000 - 细菌内毒素检查法应用指导原则规格与用法 - 药典信息平台
- 细菌内毒素检查法应用指导原则药典2000解读
- 细菌内毒素检查法应用指导原则用法用量注意事项
- 细菌内毒素检查法应用指导原则与其他药品的相互作用
- 细菌内毒素检查法应用指导原则鉴别
细菌内毒素检查法应用指导原则
附录ⅪⅩ F 细菌内毒素检查法应用指导原则
为了将细菌内毒素检查法广泛应用于药品、生物制品的质量控制，特制订本指导原则。
本指导原则适用于药品、生物制品细菌内毒素检查法(附录Ⅺ E)中的凝胶法，也可用于细菌内毒
素定量
测定法，如动态浊度法、动态显色基质法和终点显色基质法。有关定量测定方法详见附。
1．细菌内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定：
L＝K/M
式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg.h)表示。
注
射剂，K＝5EU/(kg.h)，其中放射性药品注射剂，K＝2.5EU/(kg.h)，鞘内用注射剂，K＝0.2
EU/(kg.h)；
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或u/(kg.h)表示，人均体重按
60kg计算，注射时间小于1小时，按1小时计算。
按人用剂量计算L值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际作必要调整。
2．干扰试验 要求每个厂家至少取3个批号(不包括亚批)的供试品，用两个以上生产厂家的鲎试
剂进
行干扰试验。在确认该品种在某一浓度下不干扰细菌内毒素试验，或该品种在最低有效浓度时仍有干
扰作用
但采用某种方法能消除这种干扰，该品种方可报批采用细菌内毒素检查方法。
3．标准物质 试验中所用细菌内毒素标准物质应使用由中国药品生物制品检定所研制、标定和分
发的
细菌内毒素国家标准品和工作标准品。
4．鲎试剂 试验中所用鲎试剂必须具有国家颁发的批准文号，在用于干扰试验或供试品细菌内毒
素检
查前，所在实验室应进行灵敏度复核。
5．细菌内毒素检查用水 试验中所用细菌内毒素检查用水，应为与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵
敏度
的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
附：细菌内毒素定量测定法(浊度法和显色基质法)
浊度法和显色基质法，系分别利用细菌内毒素在与鲎试剂形成凝胶过程中具有相关的浊度变化以
及利
用两者反应过程中产生的凝固酶能使特殊底物显色，从而定量测定细菌内毒素的方法。鉴于与凝胶法
有不同
的测定原理，当测定结果有争议时，以凝胶法为准。
标准物质 试验中所用细菌内毒素标准物质应使用由中国药品生物制品检定所研制、标定和分发
的可
用于定量测定的细菌内毒素国家标准品和工作标准品。
细菌内毒素检查用水 用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，含内毒素的量应小于
0.005EU/ml。
鲎试剂 应符合定量测定要求。
试验准备 同细菌内毒素检查法(附录Ⅺ E)。
方法 1．标准曲线的可靠性试验
标准曲线的制备 用标准内毒素配成溶液并制成至少3个等比系列稀释液(稀释度为2～10)，设为
λ1、
λ2……λn(n≥3)，其中λ1为标准曲线的最低内毒素浓度。每一稀释步骤的混匀时间同细菌内毒素检查
法(附
录Ⅺ E)的要求(以下同)，每一浓度平行做3支。当阴性对照结果不超过λ1时，将全部数据进行线性回
归
分析。
判断 根据线性回归分析，标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980。否则须重新试
验。
2．供试品的干扰试验
标准曲线的制备 同标准曲线的可靠性试验。
含标准内毒素的供试品溶液的制备 首先，按下式计算供试品溶液的最大有效稀释倍数(MVD)和
干扰试验 中供试品的稀释倍数(D)。
MVD=LC/λ1
D=LC/λm
式中 L为供试品的细菌内毒素限值；
C为供试品溶液的浓度，其中当L以EU/ml表示时，D=LC/λm，D为1.0ml/ml，当L以EU/mg或
EU/u表示时，
C的单位为mg/ml或u/ml；
λm为标准曲线中最低浓度λ1和最高浓度λn(n≥3)间的中间浓度，EU/ml。
然后，用供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数(MVD)的稀释液制成含细菌内毒素国家标准品或
工作标
准品的浓度为λm的内毒素溶液。
测定与判断 将含标准内毒素的供试品溶液及相同稀释倍数的供试品溶液加入适宜的反应容器
中，每一
浓度平行做3支（孔），另取细菌内毒素检查用水做2支（孔）阴性对照。供试品和鲎试剂的加样量、
供试品和
鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂等有关说明进行。
按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Et和Es，再
按下式计算该试验条件下的回收率（R）。
Es—Et
R=——————×100％
λm
内毒素的回收率在50％～200％之间时，供试品在该试验条件下不存在干扰因素；当内毒素回收率
超出该
范围时，须采用适宜的方法消除干扰因素，且这种消除方法的有效性必须用上述干扰试验加以证实。
如未稀释或稀释倍数小于MVD的供试品溶液呈现干扰作用，应增加稀释倍数后重复试验，但稀释倍数不
提超过MVD。
3.供试品的定量测定
方法 照供试品的干扰试验项下的方法配制下表中所示的四种溶液A、B、C和D后，加入适宜的反
应容器中，每一浓度平行做2支（孔），供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时
间等，参照所用仪器和试剂等有关说明进行。
编号 含标准内毒素及供试品溶液 平行测试数/支(孔) 用
途
A 标准内毒素系列溶液：λ1、λ2……λn(n≥3) 2(每一浓度) 标准曲
线
B 供试品溶液(稀释倍数≤MVD) 2 定
量测定
C 含标准内毒素的供试品溶液(内毒素浓度＝λm， 2 及回
收率
供试品稀释倍数≤MVD)
(％)
D 细菌内毒素检查用水 2
阴性对照
结果判断 由溶液B的结果与该品种项下规定的内毒素限值进行比较并判定。若两支（孔）中有
一支（孔）试验结果超过限值规定时，应重新试验。
如由溶液A的结果计算所得的线性回归方程的相关系数(r)的绝对值小于0.980，或由溶液B和溶液
C的结果计算所提的回收率(R)在50％～200％范围内，或阴性对照D的结果超过λ1，则试验无效。
附录ⅪⅩ F 细菌内毒素检查法应用指导原则
为了将细菌内毒素检查法广泛应用于药品、生物制品的质量控制，特制订本指导原则。
本指导原则适用于药品、生物制品细菌内毒素检查法(附录Ⅺ E)中的凝胶法，也可用于细菌内毒
素定量
测定法，如动态浊度法、动态显色基质法和终点显色基质法。有关定量测定方法详见附。
1．细菌内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定：
L＝K/M
式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg.h)表示。
注
射剂，K＝5EU/(kg.h)，其中放射性药品注射剂，K＝2.5EU/(kg.h)，鞘内用注射剂，K＝0.2
EU/(kg.h)；
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或u/(kg.h)表示，人均体重按
60kg计算，注射时间小于1小时，按1小时计算。
按人用剂量计算L值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际作必要调整。
2．干扰试验 要求每个厂家至少取3个批号(不包括亚批)的供试品，用两个以上生产厂家的鲎试
剂进
行干扰试验。在确认该品种在某一浓度下不干扰细菌内毒素试验，或该品种在最低有效浓度时仍有干
扰作用
但采用某种方法能消除这种干扰，该品种方可报批采用细菌内毒素检查方法。
3．标准物质 试验中所用细菌内毒素标准物质应使用由中国药品生物制品检定所研制、标定和分
发的
细菌内毒素国家标准品和工作标准品。
4．鲎试剂 试验中所用鲎试剂必须具有国家颁发的批准文号，在用于干扰试验或供试品细菌内毒
素检
查前，所在实验室应进行灵敏度复核。
5．细菌内毒素检查用水 试验中所用细菌内毒素检查用水，应为与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵
敏度
的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
附：细菌内毒素定量测定法(浊度法和显色基质法)
浊度法和显色基质法，系分别利用细菌内毒素在与鲎试剂形成凝胶过程中具有相关的浊度变化以
及利
用两者反应过程中产生的凝固酶能使特殊底物显色，从而定量测定细菌内毒素的方法。鉴于与凝胶法
有不同
的测定原理，当测定结果有争议时，以凝胶法为准。
标准物质 试验中所用细菌内毒素标准物质应使用由中国药品生物制品检定所研制、标定和分发
的可
用于定量测定的细菌内毒素国家标准品和工作标准品。
细菌内毒素检查用水 用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，含内毒素的量应小于
0.005EU/ml。
鲎试剂 应符合定量测定要求。
试验准备 同细菌内毒素检查法(附录Ⅺ E)。
方法 1．标准曲线的可靠性试验
标准曲线的制备 用标准内毒素配成溶液并制成至少3个等比系列稀释液(稀释度为2～10)，设为
λ1、
λ2……λn(n≥3)，其中λ1为标准曲线的最低内毒素浓度。每一稀释步骤的混匀时间同细菌内毒素检查
法(附
录Ⅺ E)的要求(以下同)，每一浓度平行做3支。当阴性对照结果不超过λ1时，将全部数据进行线性回
归
分析。
判断 根据线性回归分析，标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980。否则须重新试
验。
2．供试品的干扰试验
标准曲线的制备 同标准曲线的可靠性试验。
含标准内毒素的供试品溶液的制备 首先，按下式计算供试品溶液的最大有效稀释倍数(MVD)和
干扰试验 中供试品的稀释倍数(D)。
MVD=LC/λ1
D=LC/λm
式中 L为供试品的细菌内毒素限值；
C为供试品溶液的浓度，其中当L以EU/ml表示时，D=LC/λm，D为1.0ml/ml，当L以EU/mg或
EU/u表示时，
C的单位为mg/ml或u/ml；
λm为标准曲线中最低浓度λ1和最高浓度λn(n≥3)间的中间浓度，EU/ml。
然后，用供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数(MVD)的稀释液制成含细菌内毒素国家标准品或
工作标
准品的浓度为λm的内毒素溶液。
测定与判断 将含标准内毒素的供试品溶液及相同稀释倍数的供试品溶液加入适宜的反应容器
中，每一
浓度平行做3支（孔），另取细菌内毒素检查用水做2支（孔）阴性对照。供试品和鲎试剂的加样量、
供试品和
鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂等有关说明进行。
按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Et和Es，再
按下式计算该试验条件下的回收率（R）。
Es—Et
R=——————×100％
λm
内毒素的回收率在50％～200％之间时，供试品在该试验条件下不存在干扰因素；当内毒素回收率
超出该
范围时，须采用适宜的方法消除干扰因素，且这种消除方法的有效性必须用上述干扰试验加以证实。
如未稀释或稀释倍数小于MVD的供试品溶液呈现干扰作用，应增加稀释倍数后重复试验，但稀释倍数不
提超过MVD。
3.供试品的定量测定
方法 照供试品的干扰试验项下的方法配制下表中所示的四种溶液A、B、C和D后，加入适宜的反
应容器中，每一浓度平行做2支（孔），供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时
间等，参照所用仪器和试剂等有关说明进行。
编号 含标准内毒素及供试品溶液 平行测试数/支(孔) 用
途
A 标准内毒素系列溶液：λ1、λ2……λn(n≥3) 2(每一浓度) 标准曲
线
B 供试品溶液(稀释倍数≤MVD) 2 定
量测定
C 含标准内毒素的供试品溶液(内毒素浓度＝λm， 2 及回
收率
供试品稀释倍数≤MVD)
(％)
D 细菌内毒素检查用水 2
阴性对照
结果判断 由溶液B的结果与该品种项下规定的内毒素限值进行比较并判定。若两支（孔）中有
一支（孔）试验结果超过限值规定时，应重新试验。
如由溶液A的结果计算所得的线性回归方程的相关系数(r)的绝对值小于0.980，或由溶液B和溶液
C的结果计算所提的回收率(R)在50％～200％范围内，或阴性对照D的结果超过λ1，则试验无效。