紫外分光光度法
附录Ⅴ A.紫外分光光度法
1.仪器的校正和检定 由于温度变化对机械部分的影响,仪器的波长经常会略有变
动,因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外,还应于测定前校正测定波长。常
用汞灯中的较强谱线237.83nm、 253.65nm、 275.28nm、296.73nm、313.16nm、334.15nm、
365.02nm、404.66nm、435.83nm、546.07nm与576.96nm,或用仪器中氘灯的486.02nm与
656.10nm谱线进行校正,钬玻璃在279.4nm、287.5nm、333.7nm、360.9nm、418.5nm、
460.0nm、484.5nm、536.2nm与637.5nm波长处有尖锐吸收峰,也可作波长校正用,但因来
源不同会有微小的差别,使用时应注意。
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波 长 /nm │ 235(最小)│ 257(最大)│ 313(最小)│ 350(最大)
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吸收系数E1% 1cm │ 124.5 │ 144.0 │ 48.62 │ 106.6
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吸收度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120℃干燥至恒重的基准重铬
酸钾约60mg,精密称定,用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000ml,在规定的波长处
测定并计算其吸收系数, 并与规定的吸收系数比较,如上表,相对偏差应在±1%以内。
杂散光的检查可按下表的试剂和浓度,配制成水溶液,置1cm石英吸收池中,在规定
的波长处测定透光率,应符合表中的规定。
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试 剂 │ 浓度% (g/ml)│ 测定用波长(nm) │ 透光率 (%)
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碘 化 钠 │ 1.00 │ 220 │ <0.8
亚 硝 酸 钠 │ 5.00 │ 340 │ <0.8
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2.对溶剂的要求 测定供试品前,应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是
否符合要求,即用1cm石英吸收池盛溶剂,以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)
测定其吸收度。溶剂和吸收池的吸收度,在220~240nm范围内不得超过0.40,在241~250
nm范围内不得超过0.20,在251~300nm范围内不得超过0.10, 在300nm以上时不得超过
0.05。
3.测定法 测定时,除另有规定外,应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照,
采用1cm的石英吸收池,在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度,以核对供
试品的吸收峰波长位置是否正确,除另有规定外,吸收峰波长应在该品种项下规定的波
长±2nm以内;否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度,并以吸收度最大
的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸收度读数,以在0.3~0.7之间的误差较小。
仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度,否则测得的吸收度会偏低;狭缝宽
度的选择,应以减小狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准,由于吸收池和溶剂本身
可能有空白吸收,因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数,再计算含量。
用作鉴别和检查项目的方法,分别按各品种项下的方法进行。鉴别项下吸收度读数
的范围可根据制剂的实际含量和供试液的稀释倍数估算。
用于含量测定的方法一般有以下几种。
(1) 对照品比较法 按各品种项下的方法,分别配制供试品溶液和对照品溶液,对
照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100%±10%,所用溶剂
也应完全一致,在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后,按下式计算供
试品中被测溶液的浓度:
C<[x]>=(A<[x]>/A<[R]>)C<[R]>
式中 C<[x]>为供试品溶液的浓度;
A<[x]>为供试品溶液的吸收度;
C<[R]>为对照品溶液的浓度;
A<[R]>为对照品溶液的吸收度。
(2) 吸收系数法 按各品种项下的方法配制供试品溶液,在规定的波长处测定其吸
收度,再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时,应注意仪器的校
正和检定。
(3) 计算分光光度法 采用计算分光光度法应慎重。本法有多种,使用时均应按各
品种项下规定的方法进行。当吸收度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时,波
长的微小变化可能对测定结果造成显著影响,故对照品和供试品测试条件应尽可能一致。
若测定时不用对照品,如维生素A测定法,则应在测定时对仪器作仔细的校正和检定。